王殊轶 邹任玲 徐秀林 谢海明 葛 斌
（上海理工大学，上海 200093）

PCR是聚合酶链反应的简称（Polymerase Chain Reaction），是由美国人Mullis于1986年发明可在体外快速扩增特定基因或PCR序列的技术。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。目前PCR技术成为应用最普遍的分子生物学技术，该项技术是生命科学研究领域中不可缺少的工具。

　　实时定量PCR（real-time PCR）技术是近几年发展起来的新技术，既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。另外，还有重复性好、省力、低费用等优点。实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量的体系。

　　1 荧光定量PCR检测技术的基本原理

　　PCR反应程序参数（即循环参数）是指PCR循环中每一反应步骤的温度、时间和循环次数。PCR扩增是通过变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）三个步骤反复循环来实现的。因此，确定正确的PCR反应程序参数是PCR成功的保证。

　　（1）变性温度和时间：变性的目的是要使双链DNA完全解链成单链。原则上变性步骤要高温、短时，既要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。若变性不充分，DNA双链会很快恢复，PCR产物就会明显减少；反之，变性温度过高、时间过长，会加快酶的失活 。典型的变性条件是95℃，时间30s，对GC含量多的靶DNA序列宜用较高的变性温度。在解链温度（Tm）下，DNA的变性仅需几秒钟。Tm值与靶DNA的(G+C)含量及链长N有关。模板DNA或PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因。

　　（2）引物退火温度和时间：退火的作用是使模板DNA单链或上一轮的反应产物与引物相结合。退火温度是指引物与模板特异结合的最佳温度，是任何PCR反应最重要的参数。引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应成分中的浓度。通常退火温度比引物的解链温度（Tm）低5℃，一般用37～55℃或高一点，时间1min。通常退火温度越高，PCR扩增特异性越好。

　　（3）引物延伸温度和时间：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一加到引物末端3′-OH 末端，依据模板序列合成一条互补新链的过程。引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度 。一般在70～75℃。延伸时间取决于靶序列的长度、浓度和延伸温度，一般为1～3min。靶序列越长，浓度越低，延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，所需的延伸时间越短。

　　（4）扩增循环：DNA双链高温变性、引物退火和新链延伸这三个步骤进行反复循环的次数通常需要25～40个。若DNA反应中各项参数适宜，其适宜的循环次数主要取决于靶DNA的起始浓度。循环次数过多，产物相应增多，但会增加非特异性产物的量及其复杂度；循环次数过少，会降低DNA产量。

　　在PRC扩增原理的基础上，根据扩增产物的序列，结合两侧引物的特征，两条引物之间加入一条与扩增产物能特异性识别的探针。探针采用双荧光标记技术，其5′端标记报告基因（reporter R），靠近3′端标记淬灭基因（quencher Q）针完整的条件下报告基因产生荧光会被淬灭基因完全吸收，表现为报告基因受激后不能产生荧光现象。而若PCR扩增过程中有特异靶基因存在，标记探针在退火过程中与目标基因特异性结合，PCR延伸过程中，当引物延伸到探针位置时，Taq酶便以其5′端的报告基因摆脱了3′端淬灭基因的抑制，恢复荧光特性，从而荧光检测系统可以接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号与PCR产物的形成是完全同步的，荧光信号的强弱与PCR产物的数量成正比。这样无需打开扩增管，在扩增过程中，或扩增完成后，只要通过适当的设备动态检测扩增产物的荧光强度即可推算出扩增产物的量，实现实时跟踪自动化检测或终点分析PCR检测的目的。

　　定量检测的步骤：（1）确定CT值(C表示循环数Cycle，T表示荧光域值Threshold)，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。因此CT值的重现性极好，即同一模 板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的CT值是恒定的。（2）利用标准曲线对未知样品进行定量测定。获得未知样品的CT值后，从标准曲线计算出该样品的起始拷贝数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小。 实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线的方法，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。

　　2 荧光定量基因检测系统的总体设计

　　根据上述原理，我们进行了荧光定量基因检测系统的设计与开发，总体的结构如图1、2所示。该系统主要包括加基因扩增加热制冷系统与荧光检测子系统。并对这两个系统通过用户操作子系统进行了计算机实时控制，用户可以利用本操作所提供的软件，通过标准曲线对未知模板可以进行定量分析。

　　（1）基因扩增加热制冷子系统：本系统采用变温式设计，温度范围为0℃～100℃。用半导体加热制冷技术，通过半导体元件式/光加热/冷却装置变换三个温度参数，实现扩增样品不用转换。优点是设备体积小，温度变换平稳，升降温速率0.1℃，有利于保持Taq DN A聚合酶的活性，但需时较长（30个循环较水浴加热制冷方法长1～2h）。载样台采用PC-802：0.2mlx 96管固定在样台。

　　（2）光学检测子系统利用荧光检测原理，从光源发出的光经过滤光片，由96根光纤直接导入样品管，同时被激发的荧光信号由光纤传导，通过滤光片和透镜聚焦至CCD摄像系统，并在数秒内同时完成96个样品的荧光信号的采集和分析工作。光学检测子系统的结构如图3所示。图4为96个样品管的输入与输出光纤布置原理图。

　　（3）控制系统与数字图像处理系统：在控制系统中用户可对扩增的循环过程进行控制。在本荧光定量检测系统中，界面的制作采用了VB编程，在扩增过程中将实时荧光信号及温度信号经过处理，以数字和曲线的方式清晰的显示出来；同时能对采集的数据进行离线处理，对于样品的起始数通过样品与标准曲线进行比对来进行定量，同时可将结果进行保存和打印，实现PCR的实时监控。
　　
　　3 结论

　　（1）传统上基因经过PCR技术扩增后，要通过凝胶电泳检测PCR产物，染色，并在紫外投射仪下检查凝胶并摄影拍照，再根据扩增出的条带进行分析。本系统将基因扩增系统与荧光检测系统相结合，直接通过用户操作系统观察扩增结果，使PCR方法变得更加简单、快速、可靠，减少了操作环节，并且减少了操作过程中的污染问题。

　　（2）本系统实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品CT值的计算，根据标准曲线获得定量结果。