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关于光学显微镜,掌握这么多就够了!

2018-11-29 08:30 阅读: 105 评论: 0 编辑: ygzx1
[导读]显微镜,作为在科学实验中的一个基本实验仪器,它既神奇又简单。说它神奇,因为它能使观察者“看得更小”,能使物体“变得更大”,从而使人们领略到另外一个完全不同的世界景观。说它简单,是因为它就是一个可以放大 ...
显微镜,作为在科学实验中的一个基本实验仪器,它既神奇又简单。说它神奇,因为它能使观察者“看得更小”,能使物体“变得更大”,从而使人们领略到另外一个完全不同的世界景观。说它简单,是因为它就是一个可以放大物体的凸透镜。
普通光学显微镜的构造


显微镜的使用和规律
1.使用步骤
取镜、安放--对光--压片--观察
2.目镜和物镜
物镜有螺纹,目镜没有;物镜越长放大倍数越大,目镜相反。
3.成像规律--放大倒立的虚像--上下相反左右相反
①假设在视野中看到物象在如图所示,则物体实际上在哪?或者说想将物象移到视野中央,怎么移动?
②假如在显微镜视野中看到一个字母P,则实际上是________。
③假如在视野中看到细胞质在顺时针转动,则实际上怎样转动?
大绝招:这类问题的简单解决办法是把原图平面旋转180°
4.放大倍数--等于目镜放大倍数X物镜放大倍数
①一行细胞
②充满整个视野
若视野中细胞为单行,计算时只考虑长度和宽度(与放大倍数成反比);若视野中充满细胞,计算时考虑面积的变化(与放大倍数的平方成反比),细胞数量与放大倍数的变化规律如下:

低倍镜下放
大倍数为a
高倍镜下放
大倍数为na
视野中一行细胞数量
c
c×(1/n)
圆形视野内
细胞数量
d
d×(1/n2)
显微镜的工作原理
光学显微镜由两组镜片(目镜和物镜)组成,每组镜片相当于一个凸透镜。物镜的焦距很短,目镜的焦距较长。工作原理:物体先经过物镜成放大的实像,再经目镜成放大的虚像,二次放大,便能看清楚微小的物体。
1 显微镜的基本光学原理
(一) 折射和折射率
光线在均匀的各向同性介质中,两点之间以直线传播,当通过不同密度介质的透明物体时,则发生折射现象,这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时,光线在其介面改变了方向,并和法线构成折射角。
(二) 透镜的性能
透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件,物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同,可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。
当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点,这个点称"焦点",通过交点并垂直光轴的平面,称"焦平面"。焦点有两个,在物方空间的焦点,称"物方焦点",该处的焦平面,称"物方焦平面";反之,在象方空间的焦点,称"象方焦点",该处的焦平面,称"象方焦平面"。
光线通过凹透镜后,成正立虚像,而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来,而虚像不能。
(三) 凸透镜的五种成象规律
1. 当物**于透镜物方二倍焦距以外时,则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象;
2. 当物**于透镜物方二倍焦距上时,则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象;
3. 当物**于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象;
4. 当物**于透镜物方焦点上时,则象方不能成象;
5. 当物**于透镜物方焦点以内时,则象方也无象的形成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。
2 光学显微镜的成象(几何成象)原理
只有当物体对人眼的张角不小于某一值时,肉眼才能区别其各个细部,该量称为目视分辨率ε。在最佳条件下,即物体的照度为50~70lx及其对比度较大时,可达到1'。为易于观测,一般将该量加大到2',并取此为平均目镜分辨率。
物体视角的大小与该物体的长度尺寸和物体至眼睛的距离有关。有公式y=Lε
距离L不能取得很小,因为眼睛的调节能力有一定限度,尤其是眼睛在接近调节能力的极限范围工作时,会使视力极度疲劳。对于标准(正视)而言,最佳的视距规定为250mm(明视距离)。这意味着,在没有仪器的条件下,目视分辨率ε=2'的眼睛,能清楚地区分大小为0.15mm的物体细节。
在观测视角小于1'的物体时,必须使用放大仪器。放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的。
(一) 放大镜的成像原理
表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像,光路图如图1所示。位于物方焦点F以内的物AB,其大小为y,它被放大镜成一大小为y'的虚像A'B'。
放大镜的放大率
Γ=250/f'
式中250--明视距离,单位为mm
f'--放大镜焦距,单位为mm
该放大率是指在250mm的距离内用放大镜观察到的物体像的视角同没有放大镜观察到的物体视角的比值。
(二) 显微镜的成像原理
显微镜和放大镜起着同样的作用,就是把近处的微小物体成一放大的像,以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。
图2是物体被显微镜成像的原理图。图中为方便计,把物镜L1和目镜L2均以单块透镜表示。物体AB位于物镜前方,离开物镜的距离大于物镜的焦距,但小于两倍物镜焦距。所以,它经物镜以后,必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。 A'B'位于目镜的物方焦点F2上,或者在很靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。虚像A''B''的位置取决于F2和A'B'之间的距离,可以在无限远处(当A'B'位于F2上时),也可以在观察者的明视距离处(当A'B'在图中焦点F2之右边时)。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身,而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。
(三) 显微镜的重要光学技术参数
在镜检时,人们总是希望能清晰而明亮的理想图象,这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准,并且要求在使用时,必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样,才能充分发挥显微镜应有的性能,得到满意的镜检效果。
显微镜的光学技术参数包括:数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好,它们之间是相互联系又相互制约的,在使用时,应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系,但应以保证分辨率为准。
1. 数值孔径
数值孔径简写NA,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数,是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低的重要标志。其数值的大小,分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。
数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角(u)半数的正弦之乘积。用公式表示如下:NA=nsinu/2
孔径角又称"镜口角",是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大,进入物镜的光通亮就越大,它与物镜的有效直径成正比,与焦点的距离成反比。
显微镜观察时,若想增大NA值,孔径角是无法增大的,唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理,就产生了水浸物镜和油浸物镜,因介质的折射率n值大于1,NA值就能大于1。
数值孔径最大值为1.4,这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前,有用折射率高的溴萘作介质,溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。
这里必须指出,为了充分发挥物镜数值孔径的作用,在观察时,聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。
数值孔径与其他技术参数有着密切的关系,它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比,与放大率成正比,与焦深成反比,NA值增大,视场宽度与工作距离都会相应地变小。
2. 分辨率
显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距,又称"鉴别率"。其计算公式是σ=λ/NA
式中σ为最小分辨距离;λ为光线的波长;NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大,照明光线波长越短,则σ值越小,分辨率就越高。
要提高分辨率,即减小σ值,可采取以下措施
(1) 降低波长λ值,使用短波长光源。
(2) 增大介质n值以提高NA值(NA=nsinu/2)。
(3) 增大孔径角u值以提高NA值。
(4) 增加明暗反差。
3. 放大率和有效放大率
由于经过物镜和目镜的两次放大,所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积:
Γ=βΓ1
显然,和放大镜相比,显微镜可以具有高得多的放大率,并且通过调换不同放大率的物镜和目镜,能够方便地改变显微镜的放大率。
放大率也是显微镜的重要参数,但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。
分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式:500NA<Γ<1000NA
当选用的物镜数值孔径不够大,即分辨率不够高时,显微镜不能分清物体的微细结构,此时即使过度地增大放大倍率,得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像,称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足,则显微镜虽已具备分辨的能力,但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力,应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。
4. 焦深
焦深为焦点深度的简称,即在使用显微镜时,当焦点对准某一物体时,不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚,而且在此平面的上下一定厚度内,也能看得清楚,这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层,而焦深小,则只能看到被检物体的一薄层,焦深与其他技术参数有以下关系:
(1) 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。
(2) 焦深大,分辨率降低。
由于低倍物镜的景深较大,所以在低倍物镜照相时造成困难。在显微照相时将详细介绍。
5. 视场直径(Field Of View)
观察显微镜时,所看到的明亮的圆形范围叫视场,它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。
视场直径也称视场宽度,是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大,愈便于观察。
有公式 F=FN/β
式中F: 视场直径,FN:视场数(Field Number, 简写为FN,标刻在目镜的镜筒外侧),β:物镜放大率。
由公式可看出:
(1) 视场直径与视场数成正比。
(2) 增大物镜的倍数,则视场直径减小。因此,若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌,而换成高倍物镜,就只能看到被检物体的很小一部份。
6. 覆盖差
显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准,光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变,从而产生了相差,这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。
国际上规定,盖玻片的标准厚度为0.17mm,许可范围在0.16-0.18mm,在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17,即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。
7. 工作距离WD
工作距离也叫物距,即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时,被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此,它与焦距是两个概念,平时习惯所说的调焦,实际上是调节工作距离。
在物镜数值孔径一定的情况下,工作距离短孔径角则大。
数值孔径大的高倍物镜,其工作距离小。
(四) 物镜
物镜是显微镜最重要的光学部件,利用光线使被检物体第一次成象,因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数,是衡量一台显微镜质量的首要标准。
物镜的结构复杂,制作精密,由于对象差的校正,金属的物镜筒内由相隔一定距离并被固定的透镜组组合而成。物镜有许多具体的要求,如合轴,齐焦。
齐焦既是在镜检时,当用某一倍率的物镜观察图象清晰后,在转换另一倍率的物镜时,其成象亦应基本清晰,而且象的中心偏离也应该在一定的范围内,也就是合轴程度。齐焦性能的优劣和合轴程度的高低是显微镜  质量的一个重要标志,它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关。
现代显微物镜已达到高度完善,其数值孔径已接近极限,视场中心的分辨率与理论值之区别已微乎其微。但继续增大显微物镜视场与提高视场边缘成象质量的可能性仍然存在,这种研究工作,至今仍在进行。
显微物镜与目镜在参于成象这点上是有区别的。物镜是显微镜最复杂和最重要的部分,在宽光束中工作(孔径大),但这些光束与光轴的倾角较小(视场小);目镜在窄光束中工作,但其倾角大(视场大)。当计算物镜与目镜,在消除象差上有很大差别。
与宽光束有关的象差是球差、慧差以及位置色差;与视场有关的象差是象散、场曲、畸变以及倍率包差。
显微物镜是一消球差系统。这意味着:就轴上的一对共轭点而言,消除了球差并且实现了正弦条件时,每一物镜仅有两个这种消球差点。因此,物体与象的计算位置的任何改变均导致象差变大。
1. 物镜的主要参数
(1) 放大率β
(2) 数值孔径NA
(3) 机械筒长L:在显微镜中,物镜支承面到目镜支承面之间的距离称为机械筒长。对于一台显微镜来说,机械筒长是固定的。我国规定机械筒长是160毫米。
(4) 盖玻片厚度d
(5) 工作距离WD
这些参数,大多刻在物镜筒上,如图3所示。
有一种所谓筒长无限的显微物镜,这种物镜的后方一般带有辅助物镜(也叫补偿物镜或镜筒物镜),被观察物体位于物镜前焦点上,经过物镜以后,成像在无限远,再经过辅助物镜成像在辅助物镜的焦平面上,如图4所示。在物镜和辅助物镜之间是平行光,所以中间距离比较自由一些,可以加入棱镜等光学元件。
2. 物镜的基本类型
(1) 按显微镜镜筒长度(以mm计):透射光用160镜筒,带0.17mm厚或更厚的盖玻片;反射光用190镜筒,不带盖玻片;透射光与反射光用镜筒,筒长无限大。
(2) 按浸法特征:非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。
(3) 按光学装置:透射式、反射式以及折反射式。
(4) 按数值孔径和放大倍数:低倍(NA≤0.2与β≤10X),中倍(NA≤0.65与β≤40X),高倍(NA>0.65与β>40X)。
(5) 按校正象差的情况不同,通常分为消色差物镜,半复消色差物镜,复消色差物镜,平视场消色差物镜,平视场复消色差物镜和单色物镜。
a. 消色差物镜(Achromatic objective)
这是应用最广泛的一类显微物镜,外壳上常有"Ach"字样。它校正了轴上点的位置色差(红,蓝二色)、球差(黄绿光)和正弦差,保持了齐明条件。轴外点的象散不超过允许值(-4属光度),二级光谱未校正。
数值孔径为0.1~0.15的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。数值孔径至0.2的消色差物镜由两组双胶透镜构成。当数值孔径增大到0.3时,再加入一平凸透镜,该平凸透镜决定着物镜的焦距,而其它透镜则补偿由其平面与球面产生的象差。高倍物镜的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物镜一般均为浸式,由四部分构成:前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。
b. 复消色差物镜(Apochromatic objective)
这类物镜的结构复杂,透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成,物镜的外壳上标有"Apo"字样。它对两个色光实现了正弦条件,要求严格地校正轴上点的位置色差(红,蓝二色)、球差(红,蓝二色)和正弦差,同时要求校正二级光谱(再校正绿光的位置色差)。其倍率色差并不能完全校正,一般须用目镜补偿。
由于对各种象差的校正极为完善,比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径,这样不仅分辨率高,象质量优而且也有更高的有效放大率。因此,复消色差物镜的性能很高,适用于高级研究镜检和显微照相。
c. 半复消色差物镜(Semi apochromatic objective)
半复消色差物镜又称氟石物镜,物镜的外壳上标有"FL"字样。在结构上透镜的数目比消色差物镜多,比复消色差物镜少,成象质量上,远较消色差物镜为好,接近于复消色差物镜。
d. 平视场物镜(Plan objective )
平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜,以达到校正场曲的缺陷,提高视场边缘成像质量的目的。平场物镜的视场平坦,更适用于镜检和显微照相。对于平视场消色差物镜,其倍率色差不大,不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜,则必须用目镜来补偿它的倍率色差。
e. 单色物镜
这类物镜由石英、荧石或氟化锂制的一组单片透镜构成。只能在紫外线光谱区的个别区内使用(宽度不超过20mm),可见光谱区不能采用单色物镜。这类物镜均制成反射式与折反射式系统。主要缺点是相当大一部分光束在中心被遮蔽(入瞳面积的25%)。在新型折反射系统中,由于采用半透明反射镜以及物镜的胶合结构,使这一缺点大为减轻,从而可以取消反射镜框的遮光。并且两同轴反射镜的残余象差是互相补偿的,同时用透镜组来增大数值孔径。若系统的校正满意,孔径达到NA=1.4时,中心遮蔽可不超过入瞳面积的4%。
f. 特种物镜
所谓"特种物镜"是在上述物镜的基础上,专门为达到某些特定的观察效果而设计制造的。主要有以下几种:
(a) 带校正环物镜(Correction collar objective)
在物镜的中部装有环装的调节环,当转动调节环时,可调节物镜内透镜组之间的距离,从而校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。调节环上的刻度可从0 .11--.023,在物镜的外壳上也标科有此数字,表明可校正盖玻片从0.11-0.23mm厚度之间的误差。
(b) 带虹彩光阑的物镜(Iris diaphragm objective)
在物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑,外方也可以旋转的调节环,转动时可调节光阑孔径的大小,这种结构的物镜是高级的油浸物镜,它的作用是在暗视场镜检时,往往由于某些原因而使照明光线进入物镜,使视场背景不够黑暗,造成镜检质量的下降。这时调节光阑的大小,使背景变黑,使被检物体更明亮,增强镜检效果。
(c) 相衬物镜(Phase contrast objective)
这种物镜是由于相衬镜检术的专用物镜,其特点是在物镜的后焦平面处装有相板。
(d) 无罩物镜(No cover objective)
有些被检物体,如涂抹制片等,上面不能加用盖玻片,这样在镜检时应使用无罩物镜,否则图象质量将明显下降,特别是在高倍镜检时更为明显。这种物镜的外壳上常标刻NC,同时在盖玻片厚度的位置上没有0.17的字样,而标刻着"0"。
(e) 长工作距离物镜
这种物镜是倒置显微镜的专用物镜,它是为了满足组织培养,悬浮液等材料的镜检而设计。
(五) 目镜
目镜的作用是把物镜放大的实象(中间象)再放大一级,并把物象映入观察者的眼中,实质上目镜就是一个放大镜。已知显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的,而目镜只是起放大作用。因此,对于物镜不能分辨出的结构,目镜放的再大,也仍然不能分辨出。
(六) 聚光镜
聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜,在使用数值孔径0.40以上的物镜时,则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质,而且将光线聚焦于被检物体上,以得到最好的照明效果。
聚光镜的的结构有多种,同时根据物镜数值孔径的大小,相应地对聚光镜的要求也不同 。
1. 阿贝聚光镜(Abbe condenser)
这是由德国光学大学大师恩斯特.阿贝(Ernst Abbe)设计。阿贝聚光镜由两片透镜组成,有较好的聚光能力,但是在物镜数值孔径高于0.60时,则色差,球差就显示出来。因此,多用于普通显微镜上。
2. 消色差聚光镜(Achromatic aplanatic condenser )
这种聚光镜又名"消球差聚光镜"和"齐明聚光镜",它由一系列透镜组成,它对色差球差的校正程度很高,能得到理想的图象,是明场镜检中质量最高的一种聚光镜,其NA值达1.4 。因此,在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。它不适用于4 X以下的低倍物镜,否则照明光源不能充满整个视场。
3. 摇出式聚光镜(Swing out condenser)
在使用低倍物镜时(如4X),由于视场大,光源所形成的光锥不能充满真整个视场,造成视场边缘部分黑暗,只中央部分被照亮。要使视场充满照明,就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。
4. 其它聚光镜
聚光镜除上述明场使用的类型外,还有作特殊用图的聚光镜。如暗视场聚光镜,相衬聚光镜,偏光聚光镜,微分干涉聚光镜等,以上聚光镜分别适用于相应的观察方式。
光学显微镜使用注意事项:
1、安装问题
使用光学显微镜前,首先要把显微镜的目镜和物镜安装上去。目镜的安装较为简单,主要的问题在于物镜的安装,由于物镜镜头较贵重,万一学生安装时螺纹没合好,易摔到地上,造成镜头损坏,所以为了保险起见,强调学生在安装物镜时要用左手食指和中指托住物镜,然后用右手将物镜装上去,这样即使没安装好,也不会摔到地上。
2、对光的问题
对光是使用显微镜时很重要的一步,有些学生在对光时,随便转一个物镜对着通光孔,而不是按要求一定用低倍镜对光。转动反光镜时喜欢用一只手,往往将反光镜扳了下来。所以教师在指导学生时,一定要强调用低倍镜对光,当光线较强时用小光圈、平面镜,而光线较弱时则用大光圈、凹面镜,反光镜要用双手转动,当看到均匀光亮的圆形视野为止。光对好后不要再随便移动显微镜,以免光线不能准确地通过反光镜进入通光孔。
3、正确使用准焦螺旋的问题
使用准焦螺旋调节焦距,找到物象可以说是显微镜使用中最重要的一步,也是学生感觉最为困难的一步。学生在操作过程中极易出现以下错误:
a、在高倍镜下直接调焦;
b、是不管镜筒上升或下降,眼睛始终在往目镜中看视野;
c、是不了解物距的临界值,物距调到2~3厘米时还在往上调,而且转动准焦螺旋的速度很快。
前两种错误结果往往造成物镜镜头抵触到装片,损伤装片或镜头,而第三种错误则是学生使用显微镜时最常见的一种现象。
4、物镜转换的问题
使用低倍镜后换用高倍镜,学生往往喜欢用手指直接推转物镜,认为这样比较省力,但这样容易使物镜的光轴发生偏斜,原因是转换器的材料质地较软,精度较高,螺纹受力不均匀很容易松脱。一旦螺纹破坏,整个转换器就会报废。教师应指导学生手握转换器的下层转动板转换物镜。
5、正确用眼的问题
用显微镜观察物体时,应双眼同时睁开,左眼往目镜内注视。但有不少学生往往做不到这一点,喜欢用手捂住右眼或干脆闭上右眼,这是不符合实验的观察要求的,这种不良习惯会造成左眼疲劳,同时也不能做到边观察边画图。教师在指出学生这一毛病的同时,应具体示范,告诉学生左眼要尽量贴近目镜,右眼试图向视野内注视,如此反复训练,就会达到双目同时睁开观察的要求。
显微镜的使用或操作错误,是生物实验中普遍存在的现象,我们只要认真对待,有意识地去纠正它,克服它,熟练而正确地使用显微镜是完全可以做的到的。


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